TÉMY

Kolónová chromatografia

Kolónová chromatografia


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.


Tam chromatografiou (z gréckeho χρῶμα, prepisované v khrôme, „farba“), je technika na oddeľovanie zložiek homogénnej zmesi na základe rozloženia jej zložiek medzi dve fázy, jedna stacionárna a druhá pohybujúca sa definovaným smerom. Vstĺpcová chromatografiasmer ide zhora nadol a je diktovaný sklenenou trubičkou (stĺp).

Tam stĺpcová chromatografia je konkrétna chromatografická technika, ktorá je založená na vlastnosti, že niektoré látky majú po rozpustení vo vhodných roztokoch interakciu s vhodne pripravenou pevnou matricou. Pokúsim sa lepšie vysvetliť, čo to znamená, čo som práve napísal!

Stĺpcová chromatografia: čo to je

Nie je to nič iné ako chromatografická separačná metóda, ktorá sa uskutočňuje v sklenenej kolóne. Táto technika využíva rozdiel v náboji, veľkosti, väzbovej afinite alebo iných vlastnostiach izolovaného komponentu na vytvorenie pásov s rôznymi charakteristikami.

Na fotografiách na tejto stránke vám ukážeme sekvencie súborustĺpcová chromatografiaa najmä extrakciu eluátu, čo je „čiastočne vyčistená“ látka, ktorá vychádza z koncového výlevu sklenenej kolóny.

Tamstĺpcová chromatografiaje veľmi užitočný na čistenie proteínov a na separáciu veľkého množstva látok, ktoré sa majú skúmať jednotlivo. Niekedy látky izolované sstĺpcová chromatografia strácajú vlastnosti, ktoré mali vo vnútri zmesi. Všetko závisí od technikystĺpcová chromatografiaa z látky, ktorú chcete očistiť.

Stĺpcová chromatografia: ako to funguje

Sklenená trubica je naplnená poréznym pevným materiálom, definovaným ako „stacionárna fáza„. Stacionárna fáza má vhodné chemické vlastnosti zvolené na základe látky, ktorá sa má čistiť / separovať zo zmesi. Kolóna sa potom naplní tlmivým roztokom, tiež vhodne formulovaným. Pufrovací roztok sa nazýva „mobilná fáza”A obsahuje zmes, ktorú chcete oddeliť.

Zmes, ktorá sa má oddeliť, sa rozpustí vmobilná fáza. Potom prichádza mobilná fázavrstvenéna vrcholestĺpeca presakovali cezstacionárna fáza(pevná matrica). Týmto spôsobom roztok difunduje pozdĺžstĺpeca vytvára súvislý pás pozdĺž celej stacionárnej fázy. Látky, ktoré eluujú (opúšťajú) kolónu, majú špecifické vlastnosti podľa poradia vyhýbania sa.

Aby sme to lepšie pochopili, vezmime si príklad čistenia proteínov, aj keď mobilnú fázu môže predstavovať akákoľvek zmes. Budeme mať jednotlivé proteíny eluované z stĺpec viac-menej rýchlo podľa ich vlastností.

Podľa typu stacionárnej fázy máme rôzne technikystĺpcová chromatografia, Ktoré:

  • Iónomeničová chromatografia
  • Molekulárna vylučovacia chromatografia
  • Afinitná chromatografia

Existuje tiež drahšia technika, ktorá využíva vysoký tlak, a tovysokotlaková kvapalinová chromatografiaalebo HPLC.

Iónomeničová chromatografia

V iónomeničová chromatografiapevná matrica (stacionárna fáza) je bohatá na kladné alebo záporné náboje. Je samozrejmé, žeiónomeničová chromatografiavyužíva rozdiely v druhu a intenzitečistý elektrický nábojpri určitom pH.

V takom prípadestacionárna fázaje syntetický polymér (živica) obsahujúci negatívne nabité skupiny (preto o nich hovoríme)katiónové výmenníky) alebo pozitívne nabité skupiny (hovoríme oaniónové chrastavitosti).

Vrátime sa k príkladu čistenia proteínov, rozdiel v náboji súvisí s prítomnosťou aminokyselín s určitými funkčnými skupinami. Afinita každého proteínu k nabitým skupinámstĺpecZávisí to od pH, ktoré zasa ovplyvňuje ionizačný stav funkčných skupín základných aminokyselín.

Vstĺpcová chromatografiapríprava pre mobilnú fázu je kritická. V našom príklade s proteínmi môže koncentrácia soli a pH vytvoriť gradient, ktorý môže zvýhodniť extrúziu určitých proteínov.

Iónová chromatografia: výmena katiónov

V prípade iónovou chromatografious katiónovo výmennou matricou má tuhá matrica negatívne nabité skupiny, takže proteíny s čistým pozitívnym nábojom budú z kolóny prúdiť ako posledné. Prvé zlúčeniny, ktoré vyšli zstĺpecbudú to tie so silným čistým negatívnym nábojom (odpudením z matrice), potom vyjdú látky s čiastočným negatívnym nábojom. Látky, ktoré sa majú eluovať, budú prechádzať cezstĺpecso sadzbou závislou od ich čistého náboja v použitom riešení.

Molekulárna vylučovacia chromatografia

V tomto prípade sa zmes (mobilná fáza) pridá v jednomstĺpecobsahujúce apolymérs krížovými väzbami a molekulami zizolovaťbudú oddelené podľa veľkosti. Človek si inštinktívne myslí, že z kolóny najskôr vyjdú najmenšie molekuly, v skutočnosti je to však presne naopak.

Väčšie molekuly budú nútené prejsť najkratšou cestou na koniec kolóny. Difúziou budú menšie molekuly voľne prenikať do pórov pevnej matrice a elúcia bude trvať dlhšie. Prvý zhromaždený eluát bude ten, ktorý obsahuje najväčšie molekuly.

Afinitná stĺpcová chromatografia

V stacionárnej fáze je prítomný ligand. Keď roztok, ktorý sa má oddeliť, prechádza kolónou, molekuly, ktoré majú afinitu k uvedenému ligandu, vytvoria špecifickú väzbu. Požadované látky budú zadržiavané v prvej alebo poslednej frakcii zhromaždenej podľa typu použitého ligandu.

Vysokotlaková kvapalinová chromatografia

Technikystĺpcová chromatografiapráve opísané môžu mať diskrétne rozlíšenie pásiem. Dôvod? Každá látka má tendenciu po určitom čase difundovať.

Pomocou vysokotlakových čerpadiel sa zvyšuje rýchlosť a skracuje sa čas potrebný na to, aby molekuly prešli kolónou. V tejto súvislosti sú potrebné chromatografické matice schopné odolávať silným tlakom.

Znížením času prepravy kolónou savysokotlaková kvapalinová chromatografia(HPLC) obmedzuje šírenie pásiem a výrazne zlepšuje rozlíšenie zhromaždeného eluátu.


Video: Chromatografia - podział barwników roślinnych (Smieť 2022).